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FAQs

Posted by star on 2019-04-04 15:55:31 Hits:603
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1. 液體培養基的保存是冷藏好?還是冷凍好? 
       要冷藏!!因為液體培養基經冷凍后再經溶化時,其溶液的pH值會發生改變,溶液往往變堿,某些成分溶解也會受到影響對細胞生長不利。故液體培養基一定要存放在冷藏箱中,通常液體培養基在冷藏條件下可存放6~12個月。 
2. 液體培養基中谷氨酰胺的作用及使用方法
       幾乎所有的細胞對谷氨酰胺有較高的要求,細胞需要谷氨酰胺合成蛋白質,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡。所以,各種培養液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩定,應置-20 ◦C冰凍保存,用前加入培養基中。加有谷氨酰胺的液體培養基4 ◦C 冰箱儲存兩周以上時,應重新加入原來量的谷氨酰胺。基礎醫學細胞中心在其服務項目中配制分裝了高濃度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1 mL/支)。每支1 mL的谷氨酰胺加到99 mL完全培養基中,其終濃度為2mM/mL培養基。包裝為粉紅色,-24◦C保存。 
3. 培養用液pH對細胞生長的影響 
       由于,大多數細胞適宜pH為7.2~7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同,原代培養細胞一般對pH變動耐受差,無限細胞系耐受力強。 
但總體來說,細胞耐酸性比耐堿性強一些,偏酸環境中更利于細胞生長。因此,我們在配制培養用液時,可把液體的pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10μm或0.22μm濾膜過濾時,溶液的pH還會向上浮動0.2左右。 
4. 常用培養基及培養用液的滲透壓范圍 
培養基名稱             滲透壓范圍(mOSM) 
DMEM(高糖)     315 ~ 350 
DMEM(低糖)     270 ~ 330 
RPMI-1640            260 ~ 290 
MEM-EBSS            280 ~ 310 
MEM-NEAA           280 ~ 310 
McCoy5a               280 ~ 310 
MEM-a                  280 ~ 310 
M-199                   275 ~ 305 
IMDM                    270 ~ 300 
DMEM/F-12          280 ~ 310 
F-10                       270 ~ 300 
F-12                       275 ~ 300 
L-15                       280 ~ 320 
D-Hanks                280 ~ 300 
Hanks                    280 ~ 300 
PBS                        275 ~ 300 
5. 細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎? 
       不見得!因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下,pH 8.0 , 溫度 37 °C其作用能力最強。另外,鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養瓶,以便于將含血清的培養基沖洗干凈,這樣就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液濃度為: 
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA;
(2)0.25%胰蛋白酶+0.03% EDTA; 
(3)0.25% 胰蛋白酶。 
溶液pH 8.0~9.0;使用D-Hank液配制。 
多數細胞傳代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA這種消化液。  
  
6. 培養基在使用過程中應注意的問題: 
(1)培養基在使用前需37 ◦C預熱或在室溫平衡后再使用。 
(2)細胞培養過程中,吸取過培養液的吸管不能再用火焰燒灼,防止殘留在吸管內的培養基焦化,將有害物質帶入培養液中。 
(3)盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間。 
(4)避免液體間、細胞間的交叉污染。 
(5)配制完全培養基時,配制的量最好在2周內用完為好。 
  
7. 血清的有關問題: 
新生牛血清:新出生牛5天內取血制成 
小牛血清:小牛出生16周以內采血制成。 
胎牛血清:(進口血清)要求剖腹取胎制成。 
國內廠家往往不能做到,經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。 
根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為: 
(1)特級胎牛血清:40nm過濾,內毒素含量≤10EU,血紅蛋白含量≤10mg/dL。 
(2)優等胎牛血清:經過3次100nm過濾,內毒素含量≤25EU/mL,血紅蛋白含量≤25mg/mL。 
(3)標準胎牛血清:3次100nm過濾,低內毒素,低血紅蛋白含量。 
(4)活性碳/葡聚糖處理血清:激素含量大大降低。 
(5)透析型胎牛血清:次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 
  
8. 其他細胞培養用液:除培養基、血清、谷氨酰胺外,其他幾種液體也屬必須,不可省略。 
(1)雙抗:200倍,(1 mL/支)其終濃度為青霉素100U/ mL;鏈霉素100μg/mL,-24 °C保存。 
(2)L-谷氨酰胺:100倍(1 mL/支), 終濃度2 mM,-24 °C保存。 
(3)丙酮酸鈉:配制濃度50 mM,4 mL/支,終濃度為1 mM/mL, -24 °C保存。 
(4)Hepes液:配制濃度1M(5 mL/支),一支Hepes加入到200 mL完全培養基中,終濃度為25 mM/mL,常溫保存。 
  
9. 支原體污染及檢測: 
(1)支原體污染在細胞培養中最常見、不易被查覺,但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物,它無細胞壁,形態呈高度多形性,最小直徑0.2μm,可通過濾器。 
       目前中心通過對國內100余株/系細胞的檢測,形勢不容樂觀。污染率達30% ~ 60% 。課題組從國外引進細胞株/系也經常出現支原體的污染。支原體在污染細胞后,它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養基中的氨基酸來抑制細胞的生長,并能降低細胞的融合率。因此,在運用各種細胞系進行實驗研究時,首先要證明所用細胞有無支原體的污染。 
(2)支原體污染后,培養基可不發生渾濁,細胞病變輕微或不明顯,因此難以發現。目前,支原體檢測的方法有以下幾種。 
(a)相差顯微鏡觀察;
(b)低張處理地衣紅染色法; 
(c)熒光染色法;
(d)酶標法; 
(e)PCR法:基礎醫學細胞中心使用該方法進行檢測。 
優點:靈敏度高,檢測耗時短,樣品量小 (只需50 μL細胞培養用液上清)。 
缺點:引物及制劑費用較高。
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